​​​​Інгібітори EZH2 сприяють β-подібній регенерації клітин у молодих і дорослих донорів діабету 1 типу

Результати

Щоб дослідити реактивацію клітин-попередників підшлункової залози, ми оцінили дрібномолекулярні інгібітори GSK126 і таземетостат на регенеративну здатність β-клітин після хірургічної резекції тканин підшлункової залози людини від трьох донорів.

Молекулярне моделювання GSK126 і tazemetostat, зв'язаних з метилтрансферазою EZH2

Щоб дослідити структурний вплив на зв’язування з каталітичними доменами білка EZH2, були проведені дослідження прогнозного молекулярного моделювання. Ми повідомляємо, що інгібітори малих молекул зв’язують EZH2 з Taz, демонструючи вищу спорідненість зв’язування в каталітичному домені. Моделювання молекулярної динаміки показує значний енергетичний внесок від Y661 і C663 в каталітичному домені SET і I109 і Y111 в області SAL EZH2. Залишки, які сильно сприяють зв’язуванню домену SET, включаючи C663, F665 і F686, також беруть участь у зв’язуванні кофактора SAH/SAM, що вказує на конкурентне зв’язування GSK126 і Taz.

Інгібування EZH2 GSK126 і Tazemetostat реактивує експресію ендокринних маркерів в екзокринних клітинах.Структура полікомбного репресивного 2 (PRC2) комплексу людини, що складається з EZH2 (темно-синій), EED (світло-помаранчевий) і SUZ12 (темно-помаранчевий), відображених у мультфільмі. Каталітичний домен SET (блакитний) і петля активації SET (SAL, фіолетовий) EZH2 виділені. Зв’язуюча кишеня для інгібіторів піридину частково перекривається з SAM-зв’язуючою кишенею, показаною на зображенні поверхні. Вільні енергії зв'язування GSK126 і Taz були розраховані за допомогою MM-PBSA. Енергію зв'язування розкладали на основі кожного залишку, при цьому енергії для залишків доменів SET і SAL відображалися як середнє значення ± SEM. Структури GSK126 (бірюзовий), Taz (пурпуровий) і залишки доменів SET (блакитний) і SAL (фіолетовий) показані у вигляді паличок. b Схема виділення екзокринної тканини людини від донорів із цукровим діабетом 1 типу (T1D) і донорів без діабету, що показує розташування протокових клітин in vivo, стимульоване інгібіторами EZH2. c Аналіз RNA-seq, який демонструє диференціальну експресію канонічних β-клітинних та екзокринних маркерів, отриманих з бази даних Reactome, у тканині підшлункової залози T1D та епітеліальних клітинах протоки підшлункової залози людини після інгібування EZH2 за допомогою GSK126 або Taz. Ліва панель ілюструє асоціацію дескрипторів функціонального шляху з окремими генами. Права панель відображає диференціальну експресію генів групою інгібіторів у круглому форматі. Зміна кратності Log2 (logFC) представлена ​​розбіжними градієнтами червоного (збільшення) – синього (зменшення). Значимість експресії (зменшення значення P ) ілюструється більшим діаметром кола. Порожнисті кола є незначними змінами (ns =  P  > 0,05). d Порівняння рівнів експресії мРНК ключових регенеративних генів, які включають CK19, NGN3, PDX1 , INS , MAFA, GCK, NKX6.1, PCSK1 і PCSK2 , порівняно з H3F3A у СД1 та донорів без діабету до стимуляції інгібіторами EZH2. Експресія інсуліну ( INS ) ледве виявляється у ювенільного ЦД1 і значно знижена у дорослого донора ЦД1 порівняно з донором без діабету. Дані представлено як середнє значення експериментів, проведених із використанням донорів без діабету та донорів із ЦД1 із 3 технічними репліками, смуги похибок – SEM e Fold зміна індексу транскрипційної експресії CK19, NGN3, PDX1, INS, MAFA, GCK, NKX6.1, PCSK1 і PCSK2 відносно H3F3AмРНК у ювенільного донора T1D. Дані представлені як середнє значення експериментів, проведених у донорів без діабету та донорів із СД1. Дослідження інгібування EZH2 повторювали 3 рази з технічними повторами.

На додаток до досліджень профілювання транскриптомів, ми також оцінили ключові гени за допомогою qRT-PCR з клітин проток підшлункової залози, отриманих від ювенільних і дорослих донорів T1D. Регенеративний TEI порівнювали з клітинами проток підшлункової залози, отриманими від дорослої людини без діабету. Подальша оцінка клітин CK19+ve, отриманих від ювенільних донорів T1D, дорослих донорів T1D і дорослих без діабету, показує, що фармакологічне інгібування EZH2 впливає на транскрипційну експресію ендокринних маркерів. Крім того, стимуляція протокових клітин від інсулінозалежних донорів T1D за допомогою GSK126 або Taz впливала на експресію мРНК інсуліну ( INS ), включаючи ключовий ген, PDX1 , вирішальний для збереження ідентичності β-клітин.

Рефрактерний вміст ендокринних генів H3K27me3 зменшується в екзокринній тканині після інгібування EZH2

Щоб визначити, чи відповідає замовчування глушіння маркерів β-клітин, PDX1 та INS в екзокринних клітинах підшлункової залози моделі, в якій EZH2 поєднується з H3K27me3, ми провели експерименти імунопреципітації хроматину (ChIP) з діабетичними та недіабетичними донорськими клітинами, стимульованими GSK126 і Taz.

Бівалентний хроматин захищає регенеративну екзокринну здатність і експресію інсуліну від стандартного пригнічення транскрипції. Схема модифікації хвоста гістону для вмісту H3K27me3, H3K27ac і H3K4me3. Також показано протокол, який використовувався для стимуляції CK19+ve протокових клітин, отриманих від ювенільних і дорослих донорів СД1, інгібіторами EZH2 протягом 48 годин і оцінювався на вміст хроматину, імунофлуоресценцію та аналізи GSIS. b GSK126 і Taz впливають на домени двовалентного хроматину в екзокринних клітинах CK19+ve людини, отриманих від ювенільного донора T1D. Кількісні ПЛР-аналізи ДНК у ChIP з використанням антитіл проти H3K27me3, H3K27ac і H3K4me3 для NGN3, PDX1, INS-IGF2, MAFA, GCK, PCSK1, PCSK2 і CK19 відображаються як розраховані кратні зміни та скориговані до контрольних значень .

У той час як аналізи імунопреципітації хроматину підтвердили, що інгібітори EZH2 знижують H3K27me3, GSK126 і Taz не впливають на рівні ацетилювання гістону в тому самому місці лізину (H3K27ac). Оскільки було запропоновано, що бівалентні домени, позначені H3K27me3 і H3K4me3, впливають на формування гістонового патерну збалансованих генів, ми також оцінили, чи може фармакологічне інгібування EZH2 змінити пригнічення за замовчуванням шляхом модифікації бівалентності гістонів. Аналіз імунопреципітації хроматину виявив підвищений вміст H3K4me3 у промоторних областях PDX1 та INS , включаючи регенеративні гени, залучені у відновлення β-клітинної функції. Ми вважаємо, що бівалентність гістонів захищає оборотно репресовані гени від типового або незворотного пригнічення транскрипції. Ці результати показують тісний зв’язок між пригніченням за замовчуванням і екзокринною регенеративною здатністю, на яку можна впливати інгібуванням EZH2.

Ex vivo екзокринні клітини здатні експресувати інсулін

Якщо супресія за замовчуванням EZH2 відповідає за зниження екзокринної компетентності шляхом запису H3K27me3 на ген INS , тоді фармакологічне деметилювання також має впливати на виробництво білка INS. Діабетичні та недіабетичні екзокринні клітини CK19+ve стимулювали GSK126 або Taz протягом 2 днів, а потім контролювали за допомогою імунофлуоресцентного фарбування за допомогою мікроскопії. Інгібітори EZH2 стимулювали вироблення інсуліну за допомогою імунофлюоресцентного фарбування в клітинах протоків CK19+ve з частотою 3 інсулін-позитивних клітини на 20 000 клітин CK19+ve, фенотип, який не спостерігався в контролі DMSO.

Екзокринні клітини, отримані від ювенільного СД1 та дорослих донорів без діабету, здатні вивільняти інсулін

Продемонструвавши, що рефрактерна природа хроматину впливає на експресію мРНК INS і білка в екзокринних клітинах, ми перевірили, чи може інгібування EZH2 також стимулювати секрецію інсуліну. Щоб оцінити регенеративну здатність діабетичних екзокринних клітин, стимульованих GSK126 і Taz, ми розробили протокол стимульованої глюкозою секреції інсуліну (GSIS). Цей аналіз оцінює функціональність протокових клітин для виробництва інсуліну в базальних (2,8 мМ глюкози) і гіперглікемічних (28 мМ глюкоза) умовах. Стимуляція GSK126 і Taz впливала на секрецію інсуліну, що реагує на глюкозу, в діабетичних і недіабетичних екзокринних клітинах. Ці результати свідчать про функціональність ключових метаболічних маркерів гомеостазу глюкози та активності зрілих β-клітин.

Інгібування EZH2 в епітеліальних клітинах протоки підшлункової залози людини сприяє підвищенню показників β-клітин

Для контролю чистоти клітинної популяції та оцінки тимчасових ефектів інгібіторів EZH2 епітеліальні клітини протоки підшлункової залози людини стимулювали протягом 48 годин за допомогою GSK126 або Taz і повертали в середовище без ліків на 48 годин. Оцінка очищених кислотою білків, що зв’язують гістони, показує, що стимуляція GSK126 і Taz через 48 годин зменшує опосередкований EZH2 вміст H3K27me3 у порівнянні з відновленням загального немодифікованого гістону H3.

Людські епітеліальні клітини підшлункової залози експресують індекси β-клітин у відповідь на фармакологічне інгібування EZH2. a Клітини стимулювали GSK126 або Tazemetostat протягом 48-годинного періоду. Потім аналізи проводили через 48 годин, а також через 48 годин після 96-годинних умов без ліків.

β-клітини людини характеризуються пермісивними доменами хроматину, які регулюють транскрипційну компетентність

Ці дослідження припускають, що рефрактерний характер хроматину визначає екзокринну супресію та пластичність β-клітин після хірургічної резекції підшлункової залози від ювенільних та дорослих донорів СД1. Це тісно відповідає індексам транскрипції, на які впливає інгібування EZH2 з використанням епітеліальних клітин підшлункової залози людини. Якщо EZH2 захищає оборотно пригнічені гени від регенеративного глушіння в клітинах проток підшлункової залози, тоді вміст гена β-клітин повинен бути зменшений для H3K27me3 і транскрипційно перетворений в активний стан. Базовий транскрипційний профіль β-клітин підшлункової залози людини EndoC-βH5 показав характерну експресію інсуліну та надійну експресію генів PDX1 , MAFA та GCK. Оскільки інсулін синтезується в β-клітинах підшлункової залози з його попередника проінсуліну, який розщеплюється прогормонними конвертазами для генерації зрілого інсуліну, ми також досліджували експресію прогормонів PCSK1 і PCSK2. Як і передбачалося, експресія маркера панкреатичних протокових клітин CK19 і маркера попередників NGN3 була ледь помітною в зрілих клітинах EndoC-βH5.

Обговорення

До цього часу регенеративний процес і придушення за замовчуванням були випадковими і не мали підтвердження. Рідкісна можливість досліджувати свіжу тканину, резектовану у донора, і наявність Таземетостату, другого інгібітора EZH2, схваленого FDA, дозволили краще охарактеризувати рефрактерну природу хроматину, підкреслюючи регенеративний бар’єр протокових клітин, отриманих із підшлункової залози у діабетиків. цукровий діабет. Спираючись на нещодавні та попередні дослідження, ми розширюємо незалежне від віку ендокринне перепрограмування екзокринної тканини, виділеної від діабетиків 1 типу.

Заміна β-клітин залишається важливою вимогою для лікування інсулінозалежного діабету. Рівень трансплантацій не відповідає кількості донорів. Крім того, приблизно 3 підшлункові залози необхідні для створення достатньої кількості острівцевих еквівалентів для трансплантації одному реципієнту.Терапія, яка може сприяти регенерації β-клітин, може зменшити ускладнення T1D. Однак епігенетичні механізми, які керують ендокринною регенерацією попередників у людей, погано вивчені. Ця прогалина в знаннях перешкоджає розвитку епігенетичних методів лікування для сприяння регенерації β-клітин, керованої протоками. Незважаючи на те, що раніше повідомлялося про різні стратегії регенерації клітин, що виробляють інсулін, це дослідження розширює результати попереднього дослідження, демонструючи епігенетичну опосередковану стратегію перепрограмування термінально диференційованих клітин проток підшлункової залози дорослої людини в β-подібні клітини, що продукують інсулін, шляхом конкретного вирішення проблеми за замовчуванням пригнічення, опосередковане метилтрансферазою EZH2.

Незважаючи на те, що EZH2 здатний зв’язувати фактор транскрипції NGN3, також оцінено, що метилтрансфераза впливає на долю ендокринних клітин NGN3- позитивних клітин підшлункової залози. У цьому дослідженні аналіз експресії генів клітин, стимульованих GSK126 або Taz від ювенільного донора СД1, продемонстрував підвищену експресію головного регулятора ендокринних клітин підшлункової залози, NGN3 , який тимчасово експресується та модулює цільові гени нижче, що призводить до зміни клітинної ідентичності. Це підтверджено попередніми дослідженнями, які використовували протоколи диференціації стовбурових клітин для генерації NGN3- позитивних клітин у мишей, видалених для EZH2. Дійсно, транскриптомний аналіз нашого дослідження ідентифікує гени, критичні для функції підшлункової залози, розвитку β-клітин і регуляції інсуліну в ювенільному СД1.

Секвенування РНК клітин, стимульованих GSK126 і Taz, показало підвищену експресію генів ISL1, NEUROD1, PTF1A і FGF10 у ювенільного донора СД1, що вказує на скоординований неогенез і дозрівання β-клітин. Крім того, передача сигналів FGF10 допомагає зберегти панкреатичний пул клітин-попередників, тоді як ISL1, NEUROD1 і PTF1A сприяють диференціюванню та дозріванню β-клітин. Спостережуване збільшення експресії INS , ймовірно, є результатом підвищеної активності цих транскрипційних факторів, які, як відомо, впливають на диференціацію та дозрівання β-клітин, що продукують інсулін. Однак наш аналіз був обмеженим, оскільки він базувався на невеликій кількості тканин, отриманих пацієнтом, і результати, на які впливають окремі транскриптоми, можливо, приховують ширші тенденції, пов’язані з регенерацією β-клітин. Подальша робота також буде потрібна для визначення загальної застосовності фармакологічного інгібування EZH2 у донорів T1D з низькою або високою залишковою активністю β-клітин.

Здатність реактивувати транскрипційну активність ключових регенеративних генів шляхом інгібування EZH2 в епітеліальних клітинах проток підшлункової залози людини відповідає модифікації хроматину та зниженому H3K27me3. У той час як бівалентність захищає оборотно репресовані гени від глушіння за замовчуванням, інгібування EZH2 ефективно підвищило H3K4me3, тим самим впливаючи на регенеративну компетентність. Наприклад, дані RNA-seq донорських і протокових епітеліальних клітин, які зазнали дії інгібіторів малих молекул, ефективно відновили експресію рецептора GPR119 і узгоджуються з його роллю в глюкозозалежній секреції інсуліну в підшлунковій залозі. За тих самих умов ex vivo ми спостерігаємо стійку експресію гена IAPP , яка тісно відповідає метаболічним дослідженням, що демонструють посилену секреторну відповідь інсуліну. Це підвищення рівня IAPP , який зазвичай ко-секретується з інсуліном β-клітинами разом із регуляцією молекул PTF1A та ADRA2C , свідчить про те, що клітини проток підшлункової залози можуть переходити до β-подібних клітин. Дійсно, підвищена експресія PTF1A свідчить про клітинну диференціацію, тоді як зниження регуляції експресії інгібітора інсуліну ADRA2C відповідає його ролі в покращенні секреції інсуліну. У сукупності наші висновки з людських протокових клітин не тільки проливають світло на регуляторні механізми, що регулюють функцію підшлункової залози, але також підкреслюють пластичність протокових клітин, отриманих з підшлункової залози. Хоча необхідно буде розглянути інші регуляторні фактори, включаючи більш ефективні методи регенерації, наші дані розкривають деталі транскрипційного контролю шляхом націлювання на EZH2, щоб прийняти β-подібний клітинний фенотип і сприяти секреції інсуліну. Крім того, хоча дані про транскриптомні протокові клітини обмежують перехід β-клітин, покращена сигнатура експресії, ймовірно, буде досягнута шляхом специфічного збагачення та аналізу клітин-мішеней, які переходять до стану β-клітин.

Фармакологічне інгібування EZH2 каталізує активацію прогеніторів підшлункової залози та дозрівання β-клітин. На схемі показано прогресування від мультипотентних попередників підшлункової залози до зрілих β-клітин, що секретують інсулін, підкреслюючи регуляторну мішень інгібіторів EZH2, GSK126 і Tazemetostat. Ці попередники, що походять з острівців Лангергансових проток підшлункової залози, зберігаються в мультипотентному стані після розвитку, пов’язаному з опосередкованою EZH2 супресією за допомогою вмісту H3K27me3, збагаченого ендокринними генами. Зменшення рівнів H3K27me3 зміщує двовалентну позначку H3K4me3 на цих попередниках у бік ендокринної лінії, позначеної активацією PTF1A , і готує ці клітини для диференціювання β-клітин. У той час як передача сигналів FGF10 стабілізує цей стан-попередник, ISL1 і NEUROD1 впливають на ендокринну активність, яка підтримує дозрівання β-клітин. Посилення регуляції GPR119 та IAPP поряд із зниженням регуляції ADRA2C послаблює інгібіторні сигнали, полегшуючи стимульовану глюкозою секрецію інсуліну.

Посилення регуляції PDX1 має вирішальне значення для початку розвитку підшлункової залози, однак після розвитку експресія PDX1 обмежується зрілими β-клітинами, де він відповідає за підтримку виробництва інсуліну. Згідно з попередніми спостереженнями та незважаючи на руйнування β-клітин в острівцях, ми виявили, що стимуляція клітин проток підшлункової залози GSK126 і Taz може впливати на експресію гена INS і корелює з експресією маркерів підтримки, які визначають β- клітини, а саме PDX1 і MAFA . Крім того, ми вперше демонструємо, що Taz може відновити експресію INS , посилюючи функціональну важливість вмісту хроматину, що регулює пригнічення транскрипції. Незважаючи на структурні відмінності двох сполук, симуляції молекулярної динаміки показують інгібування домену SET, що узгоджується з попередніми дослідженнями метилтрансферази людини. Хоча GSK126 і Taz є конкурентоспроможними інгібіторами EZH2, їхній вплив на експресію генів був відмінним, але порівнянним. Неясно, чи відображає це відмінності в схемах дозування. Наші дослідження з Taz підтверджують, що EZH2 обмежує екзокринну регенеративну здатність людини, тоді як інгібування ферменту пропонує можливу стратегію впливу на регенерацію без істотного впливу на життєздатність клітин. Крім того, наша здатність отримати тканини від донора без діабету, включаючи неповнолітнього донора СД1 (віком 7 років і тривалість діабету 1 місяць) і дорослого донора СД1 (віком 61 рік і тривалістю діабету 33 роки), дозволила нам підтримувати поняття регенеративної здатності за межами оригінального дослідження окремого випадку. Сигнатуру, подібну до регенеративних β-клітин, також спостерігали в епітеліальних клітинах проток підшлункової залози людини і, навпаки, пов’язували з дослідженнями з використанням функціонально зрілих β-клітин EndoC-βH5 людини.

Ці дослідження також показують часову регуляцію експресії генів у епітеліальних клітинах проток підшлункової залози за допомогою GSK126 і Taz. Ми спостерігаємо значне посилення індексів β-клітин після тимчасового 48-годинного впливу препаратів і супутнього зменшення модифікації H3K27me3 на генах, що тісно відповідає підвищеному H3K4me3. Ми пропонуємо двовалентні мітки триметилювання в положеннях 4 і 27 лізину гістону H3, які захищають транскрипційно пригнічені гени від незворотного глушіння. Це узгоджується з відновленим вмістом гена H3K4me3 і, ймовірно, впливає на здатність β-клітин. Нездатність постійно відновлювати транскрипцію в умовах без ліків після видалення GSK126 і Taz підтверджується оборотністю загального вмісту H3K27me3 у клітинах підшлункової залози. Більш детальне вивчення індексів експресії транскрипції надає додаткову підтримку регенеративної оборотності. Дійсно, незважаючи на умови без ліків через 96 годин, надійний транскрипційний вихід залишається і тісно відповідає зниженому вмісту гена H3K27me3. Терапевтичні наслідки цих знахідок для регенерації β-клітин явно складні. По-перше, дані про людину підтримують націлювання на EZH2 для впливу на регенеративні показники, пов’язані з розвитком β-клітин. Однак оборотність ефектів після видалення препарату підкреслює важливість стійкої модуляції епігенетичного ландшафту для досягнення довготривалих терапевтичних результатів. Крім того, це підкреслює необхідність подальших досліджень, щоб зрозуміти часову динаміку інгібування EZH2 та його потенційний вплив на диференціацію β-клітин.

Ми пропонуємо, що ключовий епігенетичний зсув сприяє траєкторії диференціації клітин-попередників протоки підшлункової залози в напрямку ідентичності β-клітин. Дійсно, наше дослідження регенеративних транскрипційних індексів, що характеризують клітини проток підшлункової залози з функціонально зрілими β-клітинами людини EndoC-βH5, підкреслює цю парадигму. Особливо вражаючим спостереженням був нерефрактерний статус регенеративного вмісту гена H3K27me3, який спостерігався в зрілих клітинах EndoC-βH5, що контрастує з вмістом гена H3K27me3, що спостерігається в наївних епітеліальних клітинах протоки підшлункової залози людини.

Висновок

При цукровому діабеті найбільш прямим механізмом репресії транскрипції, незалежно від послідовності ДНК, є метилювання гістонів. Смерть інсулінозалежної дитини, якій протягом майже чотирьох років вводили постійні цілодобові ін’єкції, є жахливим нагадуванням про домінуючу роль придушення замовчування та підкреслює його вплив на регенеративний бар’єр. Ми припускаємо, що нездатність реактивувати транскрипцію відповідає за пригнічення показників β-клітин. У поєднанні з попереднім дослідженням цілком ймовірно, що націлювання на рефрактерний хроматин може впливати на регенеративну компетентність. У той час як інші фактори, що беруть участь у регулюванні експансії попередника, необхідно буде розглянути, ми припускаємо, що спеціалізовані структури хроматину, залежного від метилювання, повинні бути подолані, щоб відновити або повернути місткість попередника. Це повторне пробудження може бути досягнуто в резистентних екзокринних клітинах шляхом інгібування EZH2-залежного глушіння, щоб відновити здатність β-подібних клітин виробляти інсулін.

---

ДЖЕРЕЛО: https://www.nature.com/

---