Епігенетична спадковість індукована дієтою в сперматозоїдних мітохондріальних РНК

Вступ

Сперматозоїди містять складний і чутливий до навколишнього середовища пул малих некодуючих РНК (sncRNA), який впливає на розвиток нащадків і фенотипи дорослих особин. Чи є сперматозоїди в придатках яєчка безпосередньо вразливими до екологічних сигналів, досі не до кінця зрозуміло.  Ми використали дві різні парадигми гострої високожирової дієти до зачаття для розмежування внеску придатка яєчка та яєчка в пул sncRNA сперматозоїдів і здоров'я нащадків. Ми показали, що сперматозоїди в придатках яєчка чутливі до навколишнього середовища та ідентифікували мітохондріальні тРНК (mt-тРНК) та їх фрагменти (mt-tsRNAs) як фактори, що переносяться сперматозоїдами. У людей mt-tsRNAs в сперматозоїдах корелюють з індексом маси тіла, а надмірна вага батька під час зачаття подвоює ризик ожиріння у нащадків і порушує метаболічне здоров'я. Секвенування sncRNA сперматозоїдів у мишей, що беруть участь у функціонуванні мітохондрій, і метаболічне фенотипування їх дикого типу нащадків, свідчать про те, що підвищення рівня mt-tsRNAs є наслідком мітохондріальної дисфункції. Транскриптомний аналіз однієї ембріональної клітини гібридних двоклітинних ембріонів продемонстрував передачу mt-тРНК від сперматозоїда до ооциту під час запліднення і передбачає їх участь у контролі транскрипції раннього ембріона. Наше дослідження підкреслює важливість здоров'я батька під час зачаття для метаболізму нащадків, показує, що mt-тРНК індукуються дієтою і переносяться сперматозоїдами, а також демонструє, у фізіологічному контексті, передачу мітохондріальних РНК сперматозоїдів від батька до нащадків під час запліднення.

Перегляньте записи заходів, що пройшли в межах Ukrainian Laboratory Diagnostics Week. 

Основна частина

Окрім Менделівської спадковості, батьки використовують альтернативні шляхи для міжпоколінної передачі інформації. Один із них — це складний, динамічний і чутливий до навколишнього середовища пул малих некодуючих РНК (sncRNA), що накопичуються у зрілих сперматозоїдах, доставляються в ооцити під час запліднення і впливають на розвиток ембріона та фенотипи дорослих особин. Виробництво зрілих гаплоїдних сперматозоїдів зі сперматогоніальних стовбурових клітин є двоетапним процесом, що складається зі сперматогенезу в сім’яних канальцях (близько 35 днів у миші), після чого сперматозоїди дозрівають в придатках яєчок (близько 7 днів у миші). Обидві фази є потенційними вікнами екологічної вразливості для сперматозоїдного епігенома. На сьогодні прийнята модель, за якою пул sncRNA сперматозоїдів змінюється під час проходження через придаток яєчка зі значним внеском епітеліальних клітин придатка яєчка, і, отже, екологічні порушення в першу чергу впливають на придаток яєчка. З іншого боку, попри наявність гематотестикулярного бар'єра, порушення, спрямовані на сперматогенез, мають міжпоколінні або навіть трансгенераційні наслідки. Ми зосередилися на міжпоколінних наслідках батьківської надмірної ваги та намагалися розмежувати відносний внесок впливу на яєчка та придаток яєчка. Поточні дослідження використовують різні варіанти експозиції до стандартної високожирової дієти (HFD; 60% жирів) — від 6 до 22 тижнів — поряд з широким спектром початкового терміну — від 4 до 9 тижнів. Ці дослідження не враховують час сперматогенезу; повідомляють про комбіновані ефекти яєчок та придатка яєчка на епігеном сперматозоїдів; і не підходять для вивчення вікон вразливості та ідентифікації екологічних сенсорів у чоловічій репродуктивній системі. Наші результати показують, що передзачаткова експозиція батька до високожирової дієти протягом 2 тижнів у віці 6 тижнів, коли перша хвиля сперматогенезу завершена, а вироблені сперматозоїди проходять дозрівання в придатках яєчка, викликає часткову проникливу глюкозну непереносимість та інсулінорезистентність у нащадків чоловічої статі. Примітно, що такий вплив не впливає на зародкові клітини в яєчках і сперматогенез не сприяє батьківським міжпоколінним ефектам. Механічно ми виявили, що тРНК, закодовані мітохондріями (mt-тРНК), та їх фрагменти (mt-tsRNAs) динамічно регулюються під впливом високожирової дієти. Наші дані свідчать про сперматозоїдне походження цих sncRNA, що відповідає їх накопиченню в сперматозоїдах придатка яєчка в порівнянні з клітинами та пов'язаними зі сперматозоїдами цитоплазматичними краплями, та відомим активним транскриптом мітохондріальної ДНК у зрілих сперматозоїдах. Два десятиліття тому було показано, що мРНК протаміну 2 і кластерину переносяться від сперматозоїдів до ооцита під час запліднення, що спричинило використання зиготних мікроін'єкцій для вивчення ролі РНК сперматозоїдів у батьківських ефектах. Ці експерименти не демонструють міжпоколінну передачу РНК сперматозоїдів, а лише наслідки їх змін у ранніх ембріонах. Використовуючи генетичну різноманітність мтДНК та транскриптоміку однієї ембріональної клітини, ми генетично простежили батьківське походження mt-тРНК у ранніх ембріонах і виявили їх перенесення від сперматозоїдів під час запліднення. Наші дані підтримують модель, за якою гострий вплив високожирової дієти викликає мітохондріальну дисфункцію в соматичних тканинах і сперматозоїдах, в яких вона компенсується підвищенням транскрипції мтДНК. Це призводить до накопичення mt-sncRNA і їх фрагментів, які епігенетично успадковуються і, ймовірно, сприяють зміні транскрипції в ранніх ембріонах і метаболізму глюкози у дорослих нащадків. Відповідно до нашої моделі, детальні фенотипові дані мишей з Міжнародного консорціуму з фенотипування мишей (IMPC) і аналізи sncRNA сперматозоїдів підкреслили зміни mt-tsRNAs сперматозоїдів внаслідок генетично індукованої мітохондріальної дисфункції та батьківського негентичного контролю гомеостазу глюкози у нащадків. Нарешті, використовуючи дві незалежні людські когорти, ми показали, що mt-tsRNAs сперматозоїдів асоціюються з індексом маси тіла (ІМТ) і що батьківський ІМТ під час зачаття є незалежним детермінантом метаболічного здоров'я нащадків. Загалом, висновки нашого дослідження підкреслюють важливість здоров'я батька під час зачаття для метаболізму нащадків, показують, що mt-тРНК (і їх фрагменти) індукуються дієтою і переносяться сперматозоїдами, а також демонструють у фізіологічному контексті епігенетичну спадковість mt-тРНК.

Сперматозоїди придатка яєчка чутливі до дієти

Щоб дослідити чутливість сперматозоїдів придатка яєчка до навколишнього середовища та визначити відносний внесок інформації від придатка яєчка і сперматогенезу до батьківських міжпоколінних ефектів, ми годували 6-тижневих мишей-самців високожировою дієтою (HFD) або низькожировою дієтою (LFD) протягом 2 тижнів. Після дієтичного впливу на самців або безпосередньо спарювали з одновіковими самками, які не зазнали впливу, для отримання покоління F1 (eHFD), або спарювали (щоб спорожнити придаток яєчка) і повертали на звичайну дієту на 4 тижні, щоб дозволити будь-яким зародковим клітинам, що піддалися впливу HFD, завершити диференціацію та дозрівання перед спарюванням.

Сперматогенез і репродуктивна здатність самців не порушується годуванням високожировою дієтою, що показано гістологією яєчок і діаметром сім'яних канальців, рухливістю сперматозоїдів та показниками успішного запліднення і розвитку до імплантації. Згідно з цим, транскриптомні аналізи на рівні загального пулу та окремих клітин круглих сперматид і яєчок показують нормальний сперматогенез і мінімальний або відсутній вплив високожирової дієти.

Двотижневий вплив високожирової дієти достатній для викликання невеликого, але значущого збільшення маси тіла і жирової тканини та зниження толерантності до глюкози у всьому організмі у піддослідних мишей. Обидва фенотипи відновлюються через 4 тижні після повернення до звичайної дієти.

Двотижневий вплив високожирової дієти на самців (eHFD) не впливає на масу тіла та склад потомства, але призводить до приблизно 30% проникливої глюкозної непереносимості у нащадків чоловічої статі, на основі чого їх розділяють на тих, хто толерантний до HFD (HFDt), і тих, хто не толерантний до HFD. Фенотип глюкозної непереносимості є стійким, оскільки він спостерігається у приплодів з чотирьох різних когорт в різні сезони та різних мишачих кімнатах, і залишається стабільним, оскільки миші HFDi залишаються значно глюкозно-непереносимими при повторній фенотипізації через 8 тижнів після першого тестування. Миші HFDi також значно інсулінорезистентні порівняно з іншими групами. Навпаки, потомство самців sHFD не показує змін у масі тіла, складі тіла або толерантності до глюкози.

Фенотипові відмінності між нащадками HFDt і HFDi відображаються унікальними транскрипційними підписами в метаболічно релевантних тканинах. Використовуючи дані генетичної експресії та досліджень асоціації на рівні геному у дітей з Лейпцизької когорти дитячої жирової тканини, ми виявили, що близько 30% генів-підписів HFDi (визначених як диференційовано експресовані в обох м'язах і жировій тканині мишей HFDi) також експресуються в людських адипоцитах і асоціюються з дитячим ожирінням. У цьому наборі генів гени ризику та захисту від дитячого ожиріння (відповідно з негативними та позитивними β-балами для стандартного відхилення індексу маси тіла (ІМТ)) кластеризуються до шляхів функції мітохондрій клітини, запальної та клітинної пластичності відповідно.

Індекс маси тіла батька впливає на здоров’я потомства

Ожиріння батьків, особливо матері, є найсильнішим фактором ризику раннього розвитку ожиріння у дітей. Щоб надати додаткові докази батьківського впливу на метаболізм потомства у людей, ми проаналізували дані з дослідження LIFE Child Study (n = 3,431; NCT02550236). Попри сильну кореляцію індексу маси тіла (ІМТ) матері як з ІМТ батька, так і з ІМТ потомства, останній також незалежно корелює з ІМТ батька. Багатофакторний регресійний аналіз підтвердив, що ІМТ батька додатково впливає на ІМТ потомства (6,5%), незалежно від ІМТ матері (20,4%) і віку (2,3%) потомства. У сім'ях зі стрункими матерями надмірна вага батька подвоює ризик ожиріння потомства, що ще більше погіршується при ожирінні батька. Висхідний ІМТ батька також асоціюється з інсулінорезистентністю (за даними індексів ISIMatsuda та HOMA-IR), при цьому ІМТ батьків має незалежні та сукупні ефекти на чутливість до інсуліну у потомства. Ефекти обох батьків залишаються значущими після врахування спорідненості та полігенних ефектів. Матері пояснюють 18% варіації стандартного відхилення ІМТ (BMI-SDS), а батьки – 6% варіації незалежно від матерів (обидва P < 0,001). Ці результати підкреслюють важливість передконцепційної маси тіла батька для метаболічного здоров'я потомства у мишей та людей. Крім того, фенотипова різниця між потомством мишей, підданих впливу HFD протягом 2 тижнів (eHFD), і потомством тих, що потім були відновлені на стандартній дієті протягом 4 тижнів (sHFD), не лише показує, що ця модель, заснована на дієті, є повністю оборотною, але також вказує на те, що сперматозоїди придатка яєчка можуть бути безпосередньо чутливі до впливів навколишнього середовища.

Mt-tsRNAs переносяться сперматозоїдами

Малі некодуючі РНК (sncRNAs) у сперматозоїдах є потенційними чутливими до дієти медіаторами батьківських епігенетичних ефектів. Ми профілювали sncRNAs з круглих сперматид і сперматозоїдів хвоста придатка яєчка у мишей, яких годували протягом 2 тижнів високожировою дієтою (eHFD-F0), і зі сперматозоїдів хвоста придатка яєчка у мишей, яких годували протягом 2 тижнів високожировою дієтою і потім відновлювали на стандартній дієті протягом 4 тижнів (sHFD-F0). Розподіли біотипів у різних зразках відповідали очікуваним профілям, при цьому tsRNAs і piwi-РНК (piRNAs) були найпоширенішими біотипами у сперматозоїдах та круглих сперматид відповідно. Диференційний аналіз експресії даних секвенування sncRNA сперматозоїдів хвоста придатка яєчка мишей eHFD-F0 показує, що близько 25% усього пулу sncRNA сперматозоїдів є чутливими до гострого впливу HFD  з переважним зниженням експресії ядерних тРНК і їх фрагментацією , включаючи 5'-фрагменти, раніше пов'язані з міжпоколінними ефектами батьківського надмірного ожиріння.

Навпаки, експресія та 5'-фрагментація mt-тРНК переважно збільшуються з приблизно 30% анотованих послідовностей, що досягають статистичної значущості. Згідно з цими даними, наші результати показують, що фрагменти, що походять від мітохондріальних рРНК, також збільшуються з приблизно 20% анотованих послідовностей, що досягають статистичної значущості (рівень хибних відкриттів < 0,05). Диференційний аналіз експресії даних секвенування sncRNA сперматозоїдів хвоста придатка яєчка мишей, що були на високожировій дієті та відновилися на стандартній дієті протягом 4 тижнів (sHFD-F0), показує мінімальні або відсутні зміни для будь-якого з біотипів.

На основі фенотипів потомства, ці результати підтверджують первинну роль епідідімісу в реакції на гострий виклик ВЖД (високожирової дієти) і припускають, що сперматозоїдні sncRNA можуть діяти як динамічні молекулярні сигнали.

У Drosophila melanogaster та людських сперматозоїдах mt-tsRNA динамічно підвищуються при короткочасній дієті з високим вмістом цукру. Щоб додатково дослідити їх асоціацію з ІМТ, ми профілювали сперматозоїдні sncRNA з еякуляту молодих, здорових фінських добровольців (n = 18, вік 19-21 рік), глибоко метаболічно фенотипованих та стратифікованих за ІМТ і жировою масою. Відносний розподіл біотипів та склад пулу tsRNA порівнянні між особами та категоріями ІМТ. Оскільки ІМТ є неперервною змінною, ми використали алгоритми аналізу неперервного диференціального експресування для виявлення sncRNA, які мають значущу лінійну асоціацію з варіацією ІМТ. Разом з майже відсутністю варіації у n-tsRNA, mt-tsRNA є єдиним біотипом, що позитивно асоціюється з ІМТ. Всього 0,5% послідовностей, анотованих до mt-tsRNA, диференційно експресуються з неперервною варіацією ІМТ, що становить усього 29 окремих послідовностей, згрупованих у 9 фрагментів, з яких 7 підвищені. Зазначимо, що знижені послідовності також є єдиними, що знижені у сперматозоїдах мишей після 2-х тижнів годування ВЖД, тоді як серед підвищених послідовностей фрагменти mt-tRNASer та mt-tRNAThr також підвищуються після гострого виклику високим вмістом цукру і знижені у сперматозоїдах від  осіб з ожирінням.

Хоча отримані з невеликої людської когорти, ці результати підкріплюють ідею, що mt-sncRNA можуть мати важливі функції у відповідь на гострі метаболічні виклики у мишей та людей.

Ядерно-кодовані tRNA в основному набуваються сперматозоїдами з епідідімосом або цитоплазматичних крапель під час епідідімального транзиту. Навпаки, mt-tRNA можуть активно транскрибуватись у сперматозоїдах, оскільки транскрипція mtDNA є специфічно активною у зрілих сперматозоїдах. Дійсно, повнорозмірні транскрипти mt-tRNA виявляються стандартною РНК-секвенцією у зрілих сперматозоїдах та підвищуються після 2-х тижнів годування ВЖД (Рис. 2h). Крім того, повторно аналізуючи загальнодоступні набори даних sncRNA-секвенування, отримані з паралельних проб епідідімосом та сперматозоїдів або sncRNA-секвенування сперматозоїдів кауди та їх асоційованих цитоплазматичних крапель, ми виявили mt-tsRNA та mt-rsRNA, майже виключно у сперматозоїдах. Це відповідає sncRNA гермінативного походження, таким як piRNA і на противагу sncRNA соматичного або змішаного походження, таких як мікроРНК та n-tsRNA. Підтверджуючи раніше опубліковані дані, наші дані одноядерного РНК-секвенування яєчок також показують, що транскрипція mtDNA зупиняється на стадії сперматоцитів, без змін після ВЖД. Разом з відсутністю виявлення mt-sncRNA у круглих сперматидів, ці результати не підтримують можливого потоку mt-sncRNA від сперматогенезу до зрілих сперматозоїдів. Вони натомість підтверджують первинну функцію зрілих сперматозоїдів у сенсингу навколишнього середовища — найімовірніше через дієтичні модифікації епідідімального мікросередовища — і додають mt-sncRNA у сперматозоїдах до пулу потенційних факторів трансдукції між поколіннями.

Епігенетична спадковість mt-tRNA

Щоб дослідити міжпоколінну передачу mtRNA, що містяться у сперматозоїдах, ми використали генетичне різноманіття індивідуальних mtDNA та материнське спадкування mtDNA. Ми створили гібридні ембріони шляхом in vitro запліднення (IVF) сперматозоїдами кауди від самців eHFD-F0 та LFD-F0 лінії C57BL/6N і ооцитами від інбредних, гомопластичних Staudach (ST; C57BL/6N-mtST) самиць. mtDNA ST та BL6 відрізняються 416 однонуклеотидними поліморфізмами (SNP) розподіленими вздовж mtDNA і присутні у деяких mt-tRNA, диференційно експресованих у сперматозоїдах кауди від мишей eHFD-F0. Ми потім профілювали транскриптоми приблизно 200 окремих гібридних ранніх двоклітинних ембріонів (ембріональний день 1.5), щоб відстежити батьківське походження mtRNA за допомогою SNP, що диференціюють два батьківські штами мишей.

Кластеризація окремих ембріонів з використанням ядерних транскриптомів на основі аналізу основних компонентів (PCA) показує повне перекриття між ембріонами, вирощеними за допомогою LFD- або HFD дієт батьків, що свідчить про відсутність глобального батьківського ефекту. Той самий аналіз з використанням мітохондріальних транскриптомів підкреслює диференціальне кластеризування між ембріонами жіночої та чоловічої статі від LFD та HFD. У той час як жіночі ембріони HFD-батьків однорідно згруповані в один кластер, ембріони чоловічої статі утворюють два незалежні кластери з ембріонами HFD_A. Щоб вивчити батьківський внесок в ембріональний пул мтРНК, ми кількісно визначили частоту батьківських алелів (виражену як гетероплазмія = 1 − материнська частота алелів) у 416 SNP у різних популяціях ембріонів. Чоловічі ембріони HFD_A демонструють підвищену гетероплазмію порівняно з ембріонами HFD_B і LFD, особливо в SNP, що потрапляють у мт-тРНК. Жіночі HFD-ембріони також демонструють підвищену гетероплазмію порівняно з LFD-ембріонами, водночас демонструючи знижену гетероплазмію на мт-тРНК  порівняно з HFD_A ембріонами (HFD_A = 12×, HFD_B = 2×, HFD_female = 3,5 × порівняно з відповідним LFD).

Із застереженням, що інші РНК сперматозоїдів також можуть успадковуватися по батьківській лінії, ці результати демонструють — у фізіологічних умовах — перенесення мтРНК від сперматозоїда до яйцеклітини під час запліднення.

Фенотип нащадків, специфічний для самців і 30% пенетрантний, робить інтригуючим переважне перенесення мт-тРНК сперми до субпопуляції HFD_A чоловічих ембріонів.

Аналіз ранньої ембріональної транскрипції

Диференціальний аналіз експресії генів виявив суттєве транскрипційне перепрограмування в ембріонах HFD_A порівняно з LFD і HFD_B, з невеликими варіаціями або без варіацій як у HFD_B, так і в ембріонів жіночої статі порівняно з їхніми відповідними контролями LFD. Аналіз генної онтології диференціально експресованих генів підкреслив кластеризацію генів, активованих в ембріонах HFD_A до термінів клітинного метаболізму, причому окисне фосфорилювання (переважно комплекс I; GO:0006119) є найвищим (скориговане значення P ( P _adj ) < 10 ⁻¹⁶ ). Передімплантаційний розвиток ссавців є прикладом безперервної метаболічної адаптації, у якій ембріони, що розвиваються, стикаються з градієнтом концентрації кисню від яйцепроводу до матки, що призводить до шестикратного збільшення окисного фосфорилювання в бластоцистах порівняно з ембріонами на стадії розщеплення. Передчасна активація окисного фосфорилювання під час передімплантаційного розвитку призводить до змін ультраструктури ембріона, структури та функції мітохондрій і непереносимості глюкози у дорослих мишей; і дієта батька може впливати на терміни розвитку до імплантації та ранній метаболізм ембріона. Хоча терміни розвитку ембріонів HFD_A зберігаються, їхній профіль експресії генів свідчить про передчасну активацію окисного метаболізму, пов’язаного з надмірною вагою від батька та успадкуванням мт-тРНК .

Мітохондріальна дисфункція імітує HFD

Окислювальне фосфорилювання має важливе значення для фізіології клітин і організму. Гострий і хронічний вплив HFD на мишей впливає на метаболічний гомеостаз і мітохондріальну функцію в мозку, периферичних тканинах і зародкових клітинах. Клітини також намагаються компенсувати мітохондріальну дисфункцію шляхом посилення транскрипції мтДНК , як це відбувається у зрілих сперматозоїдах, яким потрібні здорові мітохондрії для належної здатності до запліднення.

Порівнюючи транскриптоміку тканин від оброблених і контрольних тварин у двох поколіннях, ми виявили послідовне зниження регуляції генів, важливих для метаболізму мітохондрій у мишей, які піддавалися дієті (наприклад, метаболізму жирних кислот). У сперматозоїдах  це пов’язано з посиленням транскрипційного механізму мтДНК. Натомість ранні ембріони та соматичні тканини F ₁ демонструють послідовну активізацію генів, важливих для мітохондріального метаболізму, тоді як лише ранні ембріони зберігають батьківську регуляцію мт-тРНК.

З цих результатів ми припускаємо, що посилення мт-тРНК (та їх 5'-фрагментів) у сперматозоїдах хвоста є компенсаторною реакцією на індуковану дієтою мітохондріальну дисфункцію.

Щоб перевірити гіпотезу про те, що батьківська мітохондріальна дисфункція може впливати на мт-тРНК сперматозоїдів і індукувати непереносимість глюкози між поколіннями, ми використали системний ресурс даних фенотипу IMPC  і витягли метаболічні параметри, виміряні у нащадків дикого типу (WT) батьків, гетерозиготних за залученими генами. у структурі та функції мітохондрій. Оскільки більшість із цих генів є летальними при гомозиготності та/або погіршують фертильність, наш остаточний набір даних включав інформацію про батьківство. Кореляційний аналіз на основі Пірсона фенотипів нащадків WT вказав на специфічні батьківські ефекти із збільшенням ожиріння (жир/маса тіла) та непереносимістю глюкози (площа під кривою внутрішньоочеревинного тесту на толерантність до глюкози (AUC _ipGTT) )) головним чином у нащадків чоловічої статі. Мутантні лінії, фенотиповані IMPC, архівуються як кріоконсервована сперма та доступні для спільноти через Європейський архів мишачих мутантів (EMMA). Ми отримали заморожену сперму для трьох ліній: Mrpl23 (мітохондріальний рибосомальний білок L23), Ndufb8 (NADH: субодиниця B8 убіхіноноксидоредуктази) і Tsfm (фактор елонгації трансляції Ts, мітохондріальний). У той час як батьківська маніпуляція з Mrpl23 і Ndufb8 перепрограмує метаболізм потомства, Tsfm зазнає невдачі в цьому процесі, таким чином слугуючи відповідним негативним контролем для початкових механічних розтинів. sncRNA-seq кріоконсервованих зразків сперми з трьох ліній мутантів виявила очікуваний розподіл біотипів і вражаюче накопичення 5' mt-tsRNAs у мутантів Mrpl23 і Ndufb8, але не Tsfm. Ці результати узгоджуються з нездатністю Tsfm -мутацій перепрограмувати метаболізм глюкози у нащадків і фенокопію батьківської HFD, що підтверджує припущення, що мітохондріальна дисфункція викликає спостережувані міжгенераційні батьківські ефекти.

Висновки та перспективи

Це дослідження показує, що гостра HFD-дієта або генетична індукція мітохондріальної дисфункції у самців мишей призводить до порушення гомеостазу глюкози у самців (WT і неекспонованих) нащадків. Механічно це пов’язано з накопиченням мт-тРНК, транскрибованих і фрагментованих у зрілих сперматозоїдах і перенесених в ооцит під час запліднення. Отримані ранні двоклітинні ембріони демонструють суттєво змінену транскрипцію генів, важливих для окисного метаболізм, що, як було показано, сприяє розвитку непереносимості глюкози у дорослому віці.

Еволюційно ці відкриття представляють повністю оборотний механізм, за допомогою якого батьки-чоловіки оновлюють потомство щодо їх метаболічного здоров’я шляхом передачі мітохондріальних сигналів і, таким чином, подолання механізмів, за допомогою яких запліднені ооцити усувають мітохондрії сперми. Попри відсутність даних про зиготичні мікроін’єкції, які демонструють, що mt-tsRNAs достатні для передачі метаболічних фенотипів, і, отже, з постійним застереженням, що інші sncRNA (та епігенетичні фактори) можуть сприяти спостережуваним ефектам батьківства; міцність, міцність, динамічність і оборотність сигнатури мт-тРНК робить ці РНК, що передаються спермою, придатними кандидатами для нових стратегій моніторингу втручань у спосіб життя до зачаття, спрямованих на запобігання поширенню метаболічних розладів через батьківську епігенетичну спадковість.

Методи

Експеримент HFD–LFD на мишах (F ₀ –F ₁ )

Утримання тварин, склад раціону та стратегії розведення

Самці та самки мишей C57BL/6N були придбані в Charles River Laboratories Німеччина. Усіх тварин годували ad libitum і утримували при постійній температурі (22 ± 1 °C) і контрольованій вологості у вентильованих клітках із циклом світло/темрява 12 годин:12 годин.

Для лікування eHFD 6-тижневих мишей-самців випадковим чином розподілили на дві групи, яким протягом 2 тижнів годували очищену HFD (дієта гризунів із 60 ккал% жиру; дослідницька дієта D12492i) або контрольну дієту LFD (дієта гризунів із 10 ккал% від жиру; дослідницька дієта D12450B) і згодом спаровувався з однією незайманою самкою такого ж віку. Для лікування sHFD 6-тижневих мишей-самців випадковим чином розподілили на дві групи, яким протягом 2 тижнів годували очищену HFD (дієта гризунів з 60 ккал% жиру; дослідницька дієта D12492i) або контрольну дієту LFD (дієта гризунів з 10 ккал% від жиру; дослідницька дієта D12450B), поєднали з однією незайманою самкою (для спорожнення придатка яєчка) і повернули на стандартну дієту протягом 4 тижнів. Ці тварини згодом були злучені з однією незайманою самкою відповідного віку для створення когорти потомства.

Під час спарювання самців і самок годували ad libitum на стандартній дієті. Щоб уникнути ізоляції під час вагітності, самців вилучали з клітки після пологів, а матерів утримували індивідуально під час годування та лактації новонароджених. Розмір посліду доводили до 6–8 щоразу, коли кількість дитинчат була більшою, щоб уникнути недоїдання.

Потомство від самців LFD або HFD і неекспонованих самок WT було названо F ₁. Тварин F ₁ відлучали від грудей через 21 день після пологів і тримали на дієті ad libitum протягом усього життя.

Усі експерименти на тваринах проводилися відповідно до директиви Європейського Союзу 2010/63/EU та були схвалені відповідальними органами уряду Верхньої Баварії за номером ліцензії ROB-55.2-2532.Vet_02-17-33.

Було докладено всіх зусиль, щоб звести до мінімуму страждання шляхом дбайливого житла та господарювання. Усі процедури фенотипування були перевірені на предмет потенційних уточнень. Добробут тварин оцінювали регулярно для всіх залучених мишей. Дані експериментів на тваринах наводяться відповідно до рекомендацій ARRIVE.

Конвеєр фенотипування

Масу тіла та відносну нежирну та жирову масу вимірювали у тварин F ₀, які піддавалися впливу, до та після дієтичного тесту, а також у тварин F ₁, яких годували їжею, кожні два тижні у віці від 4 до 14 тижнів. Склад тіла визначали спектроскопією ядерного магнітного резонансу з аналізатором Minispec NMR (Brucker Optics), згідно з інструкціями виробника. ipGTTs проводили на 8- або 12-тижневих мишах F ₀ і 16- і 24-тижневих мишах F ₁ після нічного періоду голодування протягом 16 годин (з 6 вечора до 10 ранку). Вводили 2 г глюкози на кілограм маси тіла натщесерце. Рівень глюкози в крові визначали до і після ін’єкції через 15, 30, 60 і 120 хвилин за допомогою глюкометра Roche AccuChek Aviva. Зразки плазми відокремлювали від цільної крові, збирали в мікроветри з ЕДТА (Sarstedt) через 0, 30 і 60 хвилин і швидко заморожували в рідкому азоті для подальшого аналізу.

Тести на толерантність до інсуліну проводили на 25-тижневих мишах F ₁ після 6 годин голодування (з 6 ранку до 12 вечора). Мишам вводили 0,5 ОД інсуліну на кілограм маси тіла. Рівень глюкози в крові вимірювали перед внутрішньоочеревинною ін’єкцією та через 15, 30, 60 і 120 хвилин за допомогою глюкометра Roche AccuChek Aviva.

Аналіз сперматогенезу та функції сперми

Сім’яники 8-тижневих мишей, яких протягом 2 тижнів годували LFD або HFD, розрізали та обробляли для гістології (n  = 5 мишей на дієту), а також очищення круглих сперматид для РНК і sncRNA-seq (n  = 3 миші). на дієту) або додатково оброблені для одноклітинної РНК-послідовності (n  = 3 миші на дієту).

Фарбування яєчок і гістологія

Зрізи яєчок фіксували протягом 48 годин у 10% формаліні, зневоднювали серією етанолу, очищали в ксилолі та заливали парафіном. Після регідратації зрізи розміром 4 мкм фарбували гематоксиліном та еозином згідно з інструкціями виробника. Для імуногістохімічного аналізу зрізи розміром 1,5 мкм депарафінізували стандартними методами. Теплову обробку проводили для відновлення антигену в натрій-цитратному буфері. Активність ендогенної пероксидази гасили 3% H ₂ O ₂ у метанолі при кімнатній температурі протягом 5 хв. Інкубацію з первинними антитілами проводили протягом ночі при 4 °C у блокуючому буфері (TBS–Tween 1%) і проводили хромогенні реакції. Фарбування проводили за допомогою автоматичного фарбувального пристрою Discovery XT (Ventana Systems), дотримуючись попередньо встановлених протоколів. Зрізи піддавали вилученню антигену на основі EDTA протягом 20 хвилин і блокуванню білка (Dako, DS9390) протягом 12 хвилин. Потім зрізи досліджували під мікроскопом Olympus. Первинним антитілом було TRA98 (Abcam Ab82527; 1:1000); вторинним антитілом був кролячий анти-щурячий IgG H&L (HRP; Abcam Ab6734; 1:1000). Діаметри 60–70 сім’яних канальців вимірювали за площею поперечного перерізу яєчок, пофарбованих TRA98, і виражали як середнє значення горизонтального та вертикального діаметрів.

Виділення круглої сперматиди

Круглі сперматиди виділяли за допомогою модифікованого протоколу градієнта щільності, оптимізованого для круглих сперматид, як описано раніше. Під мікроскопом перевіряли мінімум 85–90% чистоти. Тотальну РНК готували за допомогою мінінабору RNAeasy Mini Kit (QIAGEN) згідно з інструкціями виробника. Концентрацію та цілісність РНК контролювали за допомогою системи біоаналізатора (Agilent), і лише зразки РНК зі значенням RIN (число цілісності РНК) > 7 розглядалися для подальшого застосування. 50 нг загальної РНК використовували для приготування загальної (Ribo-minus) та бібліотек sncRNA-seq, як описано нижче.

Виділення та аналіз сперми

Зрілі сперматозоїди хвоста очищали за допомогою процедури підпливу у мишей, яких годували HFD або LFD протягом 2 тижнів (eHFD) і/або дозволяли відновлюватися на харчовій дієті протягом 4 тижнів після дієтичного тесту (sHFD).

Коротко кажучи, хвіст і сім’явиносну протоку розрізали на маленькі шматочки, поміщали в 500 мкл середовища Доннера (25 мМ NaHCO ₃, 20 мг мл ^-1 BSA, 1 мМ пірувату натрію та 0,53% (об’єм/об’єм) DL -лактату НАТРІЮ у бульйоні Доннера: 135 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ MgSO ₄, 2 мМ CaCl ₂ і 30 мМ HEPES, pH 7,4, фільтрують через 0,22-мкМ фільтр і зберігають при кімнатній температурі), заповнені до 2 мл, центрифугували протягом 2 хвилин при 1200 об/хв, а потім інкубували при 37 °C протягом 1 години. Після цього 1,5 мл супернатанта (що складається в основному з рухливих сперматозоїдів) переносили в нову 1,5-мл пробірку, центрифугували протягом 2 хвилин при 1200 об/хв та інкубували протягом 30 хвилин при 37 °C. Потім зібрали 1 мл супернатанта та центрифугували протягом 5 хвилин при 4800 об/хв. Супернатант відкинули, а осад ресуспендували в буфері для лізису клітин (SDS 0,01%, Triton X-100 0,005%, розчинений у воді, вільній від РНКази). ) та інкубували на льоду протягом 30 хв. Потім зразки центрифугували при 4800 об/хв, промивали холодним 1× PBS, ресуспендували в 500 мкл реагенту TRIzol (Thermo Fisher) і зберігали при -80 °C до подальшої обробки. Тотальну РНК готували за допомогою набору RNAeasy Mini Kit (QIAGEN 74104) або miRNeasy Micro Kit (QIAGEN 1071023) відповідно до інструкцій виробника.

Аліквоту 10–15 мкл рухливих сперматозоїдів, промитих PBS, використовували для мікроскопічної перевірки контамінації соматичних клітин (тільки зразки без видимих ​​соматичних клітин розглядалися для подальшого застосування) і для функціонального аналізу. Концентрацію сперматозоїдів, рухливість і прогресивну рухливість розраховували за допомогою автоматизованого комп’ютерного аналізу сперми (Hamilton Thorn IVOS II) відповідно до інструкцій виробника.

ЕКО та аналіз ембріона

Виділення ооцитів і ЕКЗ проводили відповідно до стандартизованих процедур консорціуму INFRAFRONTIER, як описано раніше. Коротко, донорів чоловічих гамет піддавали евтаназії у віці 8 тижнів після 2-тижневого впливу LFD або HFD. Зрілі сперматозоїди отримували з хвоста придатка яєчка, як описано вище. Донорів яйцеклітин жіночої статі, які не зазнали впливу WT, піддавали евтаназії того ж дня у віці 10–11 тижнів після суперовуляції, індукованої 7,5 ОД сироваткового гонадотропіну вагітної кобили та 7,5 ОД хоріонічного гонадотропіну людини перед тим, як їх умертвити для збирання ооцитів. Сперму та ооцити спільно культивували протягом 4–6 годин. Згодом ооцити переносили та інкубували в культуральному середовищі людської трубної рідини (HTF) з високим вмістом кальцію при 37 °C і 5% CO ₂. Швидкість першого розщеплення (від зиготи до двоклітинного ембріона) і швидкість розвитку бластоцисти вимірювали для оцінки ембріонального розвитку та доповнювали функціональний аналіз сперматозоїдів у визначенні впливу HFD на чоловічу репродуктивну придатність. Морули перевіряли мікроскопічно та індивідуально відбирали після інкубації запліднених ооцитів у HTF з високим вмістом кальцію протягом 72 годин.

Підготовка одноклітинної бібліотеки RNA-seq яєчок Насінники 8-тижневих мишей, яких годували HFD або LFD протягом 2 тижнів (n  = 3 на групу), обробляли для отримання одноклітинної суспензії. Коротко, яєчка декапсулювали та інкубували з 1 мг/мл колагенази IV (3 хв, 37 °C), двічі промивали теплим 1 × KREBS (10 × KREBS: 3,26 г KH 2 PO 4, 139,5 г NaCl, 5,89 г MgSO). 4 ⋅ 7H 2 O, 50 г декстрози, 3,78 г CaCl 2 ⋅ 2H 2 O, 7,12 г KCl у 2 л води та фільтрують через 0,22 мкм) шляхом осадження, інкубують з ДНКазою I плюс 0,25% трипсину (Gibco; 15–20 хв) при 34 °C), фільтрують за допомогою 40-мкм фільтра, центрифугують при 600 g, 5 хв при 4 °C, двічі промивають холодним 1× KREBS і ресуспендують у 1 мл 1× PBS + 0,04% BSA. Десять тисяч клітин були спрямовані за допомогою Chromium Next GEM Chip G Single Cell і Chromium Next GEM Single Cell 3′ Gel Bead Kit v3.1. Chromium Next GEM Single Cell 3′ GEM Kit v3.1 використовувався для синтезу кДНК, а Chromium Next GEM Single Cell 3′ Library Kit v3.1 використовувався для підготовки бібліотеки відповідно до посібника користувача ChromiumNextGEMSingleCell3_v3.1_Rev_D (10x Genomics). Бібліотеки були перевірені за допомогою біоаналізатора 2100 (Agilent). Зразки секвенували на платформі Illumina NovaSeq 6000, дотримуючись кількості циклів, рекомендованих 10x Genomics.

Аналіз одноклітинної РНК яєчок

Необроблені дані секвенування демультиплексували за допомогою Cell Ranger (10x Genomics) mkfastq, щоб отримати файли fastq для кожного зразка. Демультиплексовані зчитування було оброблено та відображено в геномі миші (refdata-gex-mm10-2020-A), а також було проведено фільтрацію та підрахунок унікальних молекулярних ідентифікаторів для отримання кількості транскриптів генів на клітину (матриця штрих-кодів генів) за допомогою Cell Ranger (версія 6.0.1) функція підрахунку. Матриці підрахунку, відфільтровані Cell Ranger, для кожного зразка були імпортовані в R і створені об’єкти Seurat R (версія 4.3.0). Для кожного зразка проводили подальшу фільтрацію для відбору клітин високої якості. Ми відфільтрували необроблені лічильні матриці, виключивши клітини, що експресують менше ніж 200 генів, які можна виявити, і гени, які експресуються менше ніж у трьох клітинах. Клітини з більш ніж 40 000 виявлених ознак (nFeature_RNA) на клітину були виключені. Усі зразки були об’єднані за допомогою функції злиття. Підрахунок експресії генів нормалізували за допомогою масштабного коефіцієнта 10 000 і перетворення log(1 +  n) за допомогою функції Seurat NormalizeData. Функція CellCycleScoring була використана для визначення фази клітинного циклу, оскільки вона визначає відносну експресію великого набору генів G2/M- та S-фази. Високоваріабельні гени були ідентифіковані за допомогою функції FindVariableFeatures. Згодом об’єкт Seurat був масштабований і проаналізований PCA. Після PCA ми використали функцію RunHarmony у пакеті Harmony R 63 для інтеграції. 30 головних компонентів були використані для виконання рівномірної апроксимації різноманіття та зменшення розмірності проекції. Потім ми побудували графік найближчих сусідів за допомогою функції FindNeighbors зі зменшенням як «гармонія» та зменшенням розмірності як 1:30. Потім кластери були ідентифіковані за допомогою функції FindClusters з параметром роздільної здатності 0,3, що призвело до 18 кластерів. Маркери кожного кластера були ідентифіковані за допомогою функції FindAllMarkers з тестом суми рангів Вілкоксона. Типи клітин були призначені на основі загальнодоступних одноклітинних наборів даних сім’яників від мишей відповідного віку. Необроблені дані про експресію генів були використані для проведення диференціальної експресії генів для всіх кластерів і маси за допомогою пакета DESeq2.

Підготовка бібліотеки sncRNA-seq

10–50 нг сумарної РНК з круглих сперматид (50 нг; n  = 3 на групу) і сперматозоїдів хвоста (10 нг; n  = 3 на групу) від мишей, яких годували HFD або LFD протягом 2 тижнів, або сперматозоїдів хвоста мишей годували HFD або LFD протягом 2 тижнів, спаровували та давали відновитися на харчовій дієті протягом 4 тижнів (10 нг; n  = 3 на групу) використовували для підготовки бібліотеки sncRNA. Бібліотеки були підготовлені з використанням набору NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set для Illumina (NEB E7560S) з 5' і 3' адаптерами, розведеними 1:5, і 15 циклами ампліфікації ПЛР. Бібліотеки були перевірені за допомогою біоаналізатора 2100 (Agilent) і секвенування парного кінця (довжина зчитування = 150 пар основ (bp)) за допомогою платформи Illumina NovaSeq 6000. Попри те, що він дозволяє надійно виявляти всі біотипи sncRNA, цей метод підготовки бібліотеки не дозволяє ефективно захоплювати сильно модифіковані sncRNA, такі як tsRNA та rsRNA.

Аналіз sncRNA-seq

Якість необроблених даних секвенування було перевірено за допомогою MultiQC v1.11. Зчитування обрізано за допомогою cutadapt 2.8 відповідно до інструкцій виробника набору. Для подальшого аналізу використовували обрізані та відфільтровані за якістю зчитування. Файли секвенування були вирівняні та анотовані до геному миші (mm10) за допомогою конвеєра SPORTS1.1 65 із параметрами за замовчуванням і максимальною кількістю невідповідностей 2. Бази даних еталонного геному та малих анотацій РНК були завантажені з веб-сайту SPORTS (https:// github.com/junchaoshi/sports1.1). Це включало файли геному mm10, мікроРНК з miRbase 21, рРНК з нуклеотиду Національного центру біотехнологічної інформації (NCBI), тРНК з GtRNAdb, піРНК з pirBase і piRNAbank, іншу нкРНК з ensembl (випуск-89) і rfam 12.3. Необроблені таблиці підрахунку, створені SPORTS, були анотовані до малих біотипів РНК. Середні значення були агреговані для біотипів (rsRNA, tsRNA, miRNA, piRNA тощо) з використанням анотацій за замовчуванням у файлах результатів SPORTS. Аналіз нижче за течією було проведено, як описано раніше з невеликими модифікаціями. Коротко кажучи, підрахунки були перетворені в читання на мільйон (RPM). Фрагменти з принаймні 0,01 об/хв у всіх зразках і довжиною від 16 до 45 нуклеотидів були збережені для подальшого аналізу. Потім edgeR використовувався для ідентифікації диференціально експресованих фрагментів. Усі аналізи проводилися з використанням різних пакетів R версії 4.1.2 і Bioconductor версії 3.14.

Побудова бібліотеки RNA-seq

Конструювання та секвенування бібліотеки круглих сперматид, сперматозоїдів хвоста та морули було передано IGA Technology Services. Бібліотеки були сконструйовані за допомогою набору Nextera Library Prep Kit (Illumina) відповідно до інструкцій виробника та секвеновані на Illumina HiSeq 2500 при 75 п.н., парні кінці (круглі сперматиди та морула) або однокінцеві (сперматозоїди хвоста), з мінімальним виходом 40 мільйонів читань на зразок. Загальну РНК білої жирової тканини печінки, м’язів і придатка яєчка готували з використанням реагенту TRIzol (Thermo Fisher) згідно з інструкціями виробника. Концентрацію та цілісність РНК контролювали за допомогою системи біоаналізатора (Agilent), і лише зразки РНК зі значеннями RIN > 7 використовували для подальших застосувань. Бібліотеки секвенування були підготовлені за допомогою Quantseq 3′ mRNA-Seq mRNA Library Prep Kit FWD для Illumina (Lexogen) з індексами i7 (Lexogen) відповідно до інструкцій виробника. Бібліотеки секвенували на Illumina HiSeq 2500 на 50 bp односторонньо, з мінімальним результатом 40–50 мільйонів зчитувань на зразок.

Аналіз даних RNA-seq

Картування зчитування та диференціальний аналіз експресії проводили за допомогою програмного забезпечення AIR (Artificial Intelligence RNA-Seq) від Sequentia Biotech з наступним конвеєром: BBDuk (обрізання зчитування; BBDUkguide), STAR (зчитування відображення геному миші GRCm38 (ENSEMBL); https ://github.com/alexdobin/STAR), featureCounts (кількісна оцінка експресії генів; https://subread.sourceforge.net/featureCounts.html) і NOISeq (статистичний аналіз диференційно експресованих генів; http://bioinfo.cipf. es/noiseq/doku.php). Порівняно з іншими методами розрахунку диференціальної експресії, NOISeq є адаптивним до даних непараметричним методом, спеціально розробленим для врахування високої варіабельності між реплікатами та генами з низькими рівнями експресії, особливістю наборів даних RNA-seq як із зародкових клітин, так і з ембріонів, що розвиваються. Аналіз теплової карти та PCA проводили за допомогою веб-додатку ClustVis із використанням параметрів за замовчуванням або за допомогою GraphPad Prism 8 або 9. Були проведені аналізи збагачення за допомогою Enrichr 69 або g:Profiler 70 із параметрами за замовчуванням. Оскільки більшість із цих генів має тканино специфічну експресію, ми побудували середній логарифм 2 [FC (лікований порівняно з контролем)], для якого умовами лікування є: прямий вплив HFD на тканини F 0 (гастрокнеміус, біла жирова тканина придатка яєчка та сперма), вплив батьків на морулу (HFD проти LFD; оскільки ми маємо лише масові дані РНК-секвенування) та фенотипові дискордантні групи HFD для обох двоклітинних ембріонів (HFD_A проти HFD_B;) і дорослі тканини F 1 (HFDi проти HFDt).

Експеримент гетероплазмії

Тварини та умови утримання

Всього було використано 60 самок мишей штаму C57BL/6N-mt ST (ядерна ДНК: C57BL/6N; мтДНК: ST, GenBank номер доступу KC663621) віком від 3 до 16 тижнів. Відповідно до рекомендацій FELASA миші були вільні від специфічних патогенів і утримувалися в бар’єрних приміщеннях для гризунів. Групи з 3-4 самок містили в клітинах типу IIL IVC (Blue Line, Tecniplast). Клітки були вистелені 120 г підстилки (Lignocel Select, стружка тополі 3,5–4,5 мм, Rettenmaier) і збагачені гніздовим матеріалом (PurZellin, Paul Hartmann) (фотоперіод 12 годин: 12 годин світло/темрява). Їжа (V1534, Ssniff Spezialdiaeten) і водопровідна вода у 250 мл пляшках були доступні ad libitum. Ці експерименти були проведені у Віденському університеті (Австрія), і всі експериментальні процедури були обговорені та схвалені Комітетом з етики та добробуту Віденського університету ветеринарної медицини та національним органом влади (Федеральне міністерство освіти, науки та Дослідження) відповідно до розділу 26ff Закону про експерименти на тваринах, Tierversuchsgesetz 2012–TVG 2012 за номером ліцензії 2021-0.731.149.

Експериментальна процедура

Самок мишей лікували групами по 15 особин для суперовуляції шляхом внутрішньочеревної ін’єкції 0,1 мл CARD HyperOva (CosmoBio, від Hölzel) і через 48 годин 5 МО в 0,1 мл hCG (Chorulon; Intervet). Тварин піддавали евтаназії через 14 годин після ін’єкції hCG, яйцепроводи розсікали та ампули відкривали в краплях 90 мкл середовища HTF для збору кумулюсних комплексів ооцитів. Ооцити були запліднені in vitro спермою мишей, яких годували LFD або HFD. Сперму чотирьох різних самців на групу використовували як заморожену та розморожену сперму відповідно до протоколу EMMA (https://www.infrafrontier.eu/). У кожну дату експерименту яйцепроводи 7,5 самок використовували для ЕКЗ із HFD самцем, а яйцепроводи 7,5 самок для ЕКЗ із LFD самцем. На кожну дату використовувалися різні самці. Коротко, розморожену сперму розчиняли в 90 мкл середовища TYH та інкубували протягом 30 хв. Об’єм 10 мкл розчину сперми додавали до групи комплексів кумулюсних ооцитів та інкубували протягом 4–6 годин. Після промивання в середовищі HTF ооцити інкубували протягом ночі. Двоклітинні ембріони промивали наступного ранку в PBS, аліквотували в 0,2-мл пробірки з буфером для лізису, швидко заморожували в рідкому азоті та зберігали при -80 °C.

РНК-секвенування одного ембріона та аналіз даних

Загалом 122 HFD та 99 LFD одноклітинних ранніх двоклітинних ембріонів було оброблено для отримання бібліотек RNA-seq згідно з протоколом Smart-seq2 71 із 16 циклами попередньої ампліфікації ПЛР. Бібліотеки були перевірені за допомогою 2100 Bioanalyzer (Agilent), об’єднані та секвеновані на парних кінцях на платформі Illumina NovaSeq 6000 (довжина зчитування = 150 bp). Якість даних оцінювали за допомогою MultiQC (версія 1.11), а адаптери Nextera видаляли зі зчитування парного кінця за допомогою trim_galore (версія 0.6.6). Картування, зчитування, кількісне визначення експресії генів і диференціальний аналіз експресії проводили за допомогою наступного конвеєра: STAR (зчитує картування геному миші GRCm38 (ENSEMBL); https://github.com/alexdobin/STAR ; після заміни послідовності мтДНК відповідно до штаму C57BL/6N-mt ST ; номер доступу KC663621 ); featureCounts (кількісна оцінка експресії генів; https://subread.sourceforge.net/featureCounts.html ); DESeq2 (пакет 1.34.0; диференціальний аналіз експресії генів). Аналіз збагачення Gene Ontology (GO) диференційно експресованих генів було проведено за допомогою g:Profiler 72 із параметрами за замовчуванням.

Окремі ембріони визначали стать за допомогою ексклюзивної експресії Y-зчеплених генів. Для аналізу гетероплазмії мтДНК однозначно зіставлені зчитування були витягнуті з файлів BAM за допомогою samtools і використані для оцінки гетероплазмії мтДНК за допомогою MitoHEAR (mitochondrial heteroplasmy analyR; https://github.com/ScialdoneLab/MitoHEAR). Аналіз і візуалізація основних компонентів і кластеризації проводилися за допомогою веб-додатку ClustVis 68 із параметрами за замовчуванням. Для кластеризації окремих ембріонів на основі Seurat матриця даних підрахунку з featureCounts використовувалася як вхідні дані для пакета Seurat для обробки окремого зразка як однієї клітини. Для нормалізації підрахунків використовувалася функція Seurat NormalizeData. Високоваріабельні гени були ідентифіковані за допомогою функції FindVariableFeatures. Згодом об’єкт Seurat було масштабовано за допомогою ScaleData, а PCA було виконано за допомогою RunPCA. Функція FindNeighbors використовувалася для побудови графіка найближчих сусідів зі зменшенням розмірності 1:15. Потім кластери були ідентифіковані за допомогою функції FindClusters з параметром роздільної здатності 0,8. Одним зі специфічних обмежень цього методу є те, що smart-seq2 не може виявити фрагментовані тРНК, оскільки вони не є поліаденільованими. Щоб пояснити часткову пенетрантність повідомлених фенотипів, ми повинні мати профільовані sncRNA в окремих ембріонах. З усім тим, згідно з генетичною відстанню між мтДНК ST і BL6 (яку ми використовували для розрахунку гетероплазмії), лише 5'-фрагменти mt-Tp можна було б надійно виявити (який має SNP на 5' і 3' послідовність зрілої тРНК). Тому, хоча й дуже ймовірно, наші дані не показують перенесення мт-тРНК, демонструючи успадкування батьківських зрілих мт-тРНК.

Дослідження людини

Для оцінки зв’язку між вагою батьків і клінічним фенотипом нащадків ми проаналізували дані Лейпцизької когорти дитячого ожиріння (NCT04491344) і LIFE Child Study (NCT02550236), проспективного регіонального популяційного довгострокового обсерваційного дослідження, спрямованого на характеристику факторів, що сприяють розвитку цивілізаційної хвороби, з комплексним фенотипуванням (наприклад, клінічні, лабораторні, психосоціальні дані та біозразки), включаючи дані про ІМТ батьків та ІМТ нащадків, проведені в місті Лейпциг, Німеччина. З віком набору в діапазоні від 24-го тижня вагітності до 16-річного віку дитини та щорічних спостережень дослідження поєднує в собі поперечний і поздовжній дизайн і охоплює широкий віковий діапазон. Під дослідження LIFE щодо дитячого ожиріння спеціально зосереджено на походженні та наслідках дитячого ожиріння в рамках Лейпцизької когорти дитячого ожиріння. Після виключення дітей із серйозними захворюваннями в цей час або в минулому (наприклад, діабет 1 типу, синдром ожиріння або рак) і поточне або минуле лікування, що заважає (наприклад, інсулін, імунодепресанти або гормон росту), ми включили дітей з ІМТ обох батьків доступні для аналізу (n  = 3431; додаткова таблиця 3). У разі багаторазових візитів ми використовували антропометричні дані останнього візиту дитини. Для батьківських даних ми використовували найраніші (тобто найближчі до першого відвідування вагітності). Експресію генів-кандидатів, отриманих із загальногеномних даних про експресію, було проаналізовано у дітей, включених до дитячої когорти Leipzig Adipose Tissue, для яких зразки підшкірної жирової тканини та фенотипічні дані були отримані, як описано раніше. Рівні транскриптів РНК визначали кількісно за допомогою масивів Illumina HumanHT-12 v4.0 Expression BeadChip, а імпутацію, фонову корекцію та контроль якості проводили відповідно до раніше опублікованих протоколів. Щоб виправити полігенну асоціацію ІМТ-СДС дітей, ми проаналізували 2987 дітей наших когорт, для яких доступні дані про загальногеномний масив SNP, ІМТ-СДС та ІМТ батьків. Полігенний ефект на BMI-SDS дітей був вирахуваний за допомогою аналізу лінійної змішаної моделі з використанням пакета R GenABEL. Потім ми перевірили вплив ІМТ батьків на ІМТ-SDS дітей за допомогою аналізу лінійної регресії з поправкою на вік і стать.

SncRNA-seq зі сперматозоїдів людини.

Колекція зразків. Зразки були надані нашими дослідниками з Університету. Після інформованої згоди зразки сперми здали 18 молодих добровольців (19–21 рік). Чоловіки брали участь у дослідженні чоловічого репродуктивного здоров’я, яке було схвалено Об’єднаним комітетом з етики Університету Турку та Університетської лікарні Турку. Перед збором зразка сперми рекомендовано утримання від еякуляції щонайменше за 48 годин. Стандартний аналіз сперми, включаючи об’єм сперми, pH, концентрацію сперматозоїдів, загальну кількість сперматозоїдів і відсоток рухливих сперматозоїдів, проводили відповідно до критеріїв лабораторії Всесвітньої організації охорони здоров’я в андрологічній лабораторії Інституту біомедицини. Сперматозоїди очищали центрифугуванням через 50% градієнт Puresperm (Nidacon International). Після промивання зразка PBS чистоту оцінювали мікроскопічно, сперматозоїди підраховували та зразок оцінювали на контамінацію соматичних клітин. Осад ресуспендували в Sperm CryoProtec II (Nidacon International AB), а заморожений осад відправили до Німеччини. У Німеччині сперматозоїди додатково очищали від контамінації соматичних клітин шляхом промивання буфером для лізису соматичних клітин. Чистоту зразків перевіряли під мікроскопом. 

Виділення РНК. Загальну РНК екстрагували зі сперматозоїдів за допомогою методу розділення фаз TRIzol–хлороформ з подальшим етапом осадження та промивання 100% та 70% етанолом відповідно. Контроль якості РНК проводився за допомогою біоаналізатора Agilent, і лише зразки зі значенням RIN від 2 до 4,5 і без очевидних інтактних піків рибосомної РНК були додатково оброблені. Підготовка бібліотеки. Бібліотеки для секвенування були підготовлені з використанням NEBNext Small RNA Library Prep Set для Illumina (New England Biolabs) із 100–120 нг РНК як загальний вихід. Щоб мінімізувати утворення адаптор-димеру, адаптери розводили 1:6, тоді як праймер зворотної транскрипції застосовували нерозведеним. На завершальному етапі ПЛР використовували праймери, розведені 1:2. Ампліфіковані бібліотеки очищали за допомогою Monarch PCR & DNA Cleanup Kit (New England Biolabs) і вибирали розмір за допомогою AMPure XP (Beckman Coulter) з використанням кульок 1,0× і 3,7× для видалення довгих фрагментів і збереження цільового розміру відповідно. Об’єднані бібліотеки секвенували на NovaSeq 6000, SP flow cell, 100 циклів (Illumina) із середньою глибиною 53,18 мільйона зчитувань на зразок.

Аналіз даних. Якість усіх файлів секвенування було перевірено за допомогою MultiQC v1.11. Після попередньої перевірки якості однокінцеві послідовності зчитування були проаналізовані за допомогою SPORTS1.1. Адаптерну послідовність (5′-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCA-3′) обрізали за допомогою вбудованого конвеєра Cutadapt, а послідовності довжиною 15–45 нуклеотидів обробляли далі. Використовуючи версію геному людини hg19 і дозволене число невідповідності, встановлене на 2, SPORTS1.1 зіставив зчитування з малими підтипами РНК. Після об’єднання послідовностей з усіх зразків у загальну матрицю підрахунку було застосовано фільтр, щоб виключити послідовності без зчитувань у понад 80% зразків. Зразки були додатково проаналізовані на основі варіації ІМТ. Диференціальний аналіз експресії на основі послідовності проводили з використанням DESeq2, звертаючись до ІМТ як постійної змінної. Коротко кажучи, алгоритм на основі узагальненої лінійної моделі оцінював асоціацію кожної послідовності з ІМТ у зразках і виводив журнал 2 [FC], що відображає зміну рівня експресії послідовності на одиницю приросту ІМТ. Benjamini–Hochberg P adj  < 0,1 служив мірою значущості для кожного результату. Кореляційний аналіз на основі Пірсона між ІМТ донорів і біотипами sncRNA сперматозоїдів (варіансно-стабілізована трансформація-нормалізована експресія) було проведено за допомогою GraphPad Prism 8 із використанням параметрів за замовчуванням. Наступний рядок представляє код, який використовується для безперервного аналізу DESeq2 даних sncRNA-seq сперми людини: dd_obj <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = [ваша матриця підрахунку послідовностей], colData = [фрейм даних з ідентифікатором зразка та значеннями ІМТ], дизайн = ~ ІМТ).

Збір і аналіз даних. Міжнародного консорціуму фенотипування мишей Мета полягає в тому, щоб надати докази на підтримку гіпотези про те, що мітохондріальна дисфункція батька призводить до змін метаболічного гомеостазу між поколіннями. IMPC пропонує неоціненний ресурс функціональних генетичних досліджень. Коротко, ми використали набір даних IMPC для вивчення (епі)генетичних наслідків між поколіннями батьківської маніпуляції генами, залученими до структури та функції мітохондрій. Для цього ми порівняли батарею з 11 числових метаболічних фенотипів (жир/маса тіла; початкова реакція на внутрішньоочеревинне навантаження глюкозою; AUC ipGTT ; загальне споживання їжі; дихальний обмінний коефіцієнт; загальний холестерин; холестерин ЛПВЩ; тригліцериди; глюкоза крові натще; альбумін; лужна фосфатаза) у двох популяціях ізогенних мишей WT C57BL/6N, створених із чистої лінії WT (контроль) або від гетерозиготних спаровувань (WT — інформація про батьків (батько × мати): het_×_het; het_×_WT; WT_×_het).

Відбір генів

Відбір генів, які беруть участь у структурі та функції мітохондрій, проводився за такими етапами: зі списку генів IMPC (випуск даних 11) ми вилучили ті, які мають один або більше перерахованих вище метаболічних фенотипів у гетерозиготності; аналіз функціонального збагачення (аналіз шляху GO та KEGG з використанням Enrichr); список вибраних генів, складений шляхом злиття генів, що належать до наступних термінів, пов’язаних з мітохондріями.

Збір та аналіз даних

Оскільки окремі центри фенотипування IMPC контролюють фенотип та/або WT тварин і розглядають їх як контроль WT для генно-специфічних фенотипів, специфічні дані контролю або WT не можна безпосередньо ідентифікувати на веб-сайті IMPC. Тому нам було надано спеціальний доступ до даних IMPC для спеціального збору контрольної та фенотипової інформації WT. Після збору набір даних був організований у багатовимірну матрицю даних для подальшого аналізу. Тварини з принаймні трьома репліками на групу та стать були включені для подальших кроків. Імпутацію для відсутніх даних було здійснено за допомогою алгоритму випадкової імпутації з використанням пакета missForestR із параметрами за замовчуванням. Потім матрицю даних масштабували, а функцію prcomp у R використовували для визначення основних компонентів набору даних. Щоб кількісно визначити різницю між генами на основі фенотипів, ми використовуємо метод кореляції Пірсона за допомогою функції get_dist з пакету factoextra R. Ці коефіцієнти кореляції були розраховані для виявлення моделей подібності в парах ген–фенотип і візуалізовані на тепловій карті, створеній за допомогою пакета ComplexHeatmap від R. Кластерно-специфічні фенотипи візуалізувалися на тепловій карті, включаючи 11 фенотипів, а також стать і інформація про батьківство та походження. Рейтинговий AUC _ipGTT (виражений як log ₂ [FC(WT порівняно з контролем)]) був побудований як горизонтальний стовпчик за допомогою GraphPad Prism 9.

Збір кріоконсервованої сперми

Кріоконсервовані зразки сперми, що містять пул очищених сперматозоїдів 10 гетерозиготних мишей, були отримані від EMMA. Гени були відібрані для наявності, за винятком Tsfm (фактор подовження трансляції Ts, мітохондріальний), який представляє відповідний негативний контроль для початкового механічного розтину.

Виділення РНК і побудова бібліотек sncRNA-seq

Окремі частинки розморожували безпосередньо в TRIzol, а РНК екстрагували за допомогою набору miRNeasy Micro Kit (QIAGEN 1071023) відповідно до інструкцій виробника. Для приготування бібліотеки sncRNA використовували 10 нг загальної РНК. Бібліотеки були підготовлені з використанням набору NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set для Illumina (NEB E7560S) з 5' і 3' адаптерами, розведеними 1:5, і 15 циклами ампліфікації ПЛР. Бібліотеки перевіряли за допомогою біоаналізатора 2100 (Agilent) і парного кінця (довжина зчитування = 150 bp) та секвенували за допомогою платформи Illumina NovaSeq 6000.

Аналіз даних sncRNA-seq

Дані sncRNA-seq аналізували, як описано вище. Коротко, якість необроблених даних секвенування було перевірено за допомогою MultiQC v1.11. Зчитування було обрізано за допомогою cutadapt 2.8 відповідно до інструкцій виробника набору. Для подальшого аналізу використовували обрізані та відфільтровані за якістю зчитування. Файли секвенування були вирівняні та анотовані до геному миші (mm10) за допомогою конвеєра SPORTS1.1 із параметрами за замовчуванням і максимальною кількістю невідповідностей 2. Еталонний геном і невеликі бази даних анотацій РНК були завантажені з вебсайту SPORTS (https:// github.com/junchaoshi/sports1.1). Це включало файли геному mm10, мікроРНК від miRbase 21, рРНК від NCBI Nucleotide, тРНК від GtRNAdb, піРНК від pirBase та piRNAbank, іншу нкРНК від ensembl (випуск-89) і rfam 12.3. Необроблені таблиці підрахунку, створені SPORTS, були анотовані до малих біотипів РНК. Середні значення були агреговані для біотипів (rsRNA, tsRNA, miRNA, piRNA тощо) з використанням анотацій за замовчуванням у файлах результатів SPORTS.

Статистичний аналіз

Усі цифри та статистичні аналізи (за потреби та відповідності) були згенеровані за допомогою GraphPad Prism 8 або 9. Статистичну значущість перевіряли t -критерієм Стьюдента або дисперсійним аналізом відповідно. Для перевірки лінійної регресії використовували кореляційний аналіз. Коефіцієнти шансів були розраховані за допомогою MedCalc (https://www.medcalc.org/calc/odds_ratio.php). Усі дані виражені як середнє значення ± sem, а двобічне значення P < 0,05 вважалося статистично значущим, якщо інше не зазначено в тексті.

ДЖЕРЕЛО: https://www.nature.com/

На платформі Accemedin багато цікавих заходів! Аби не пропустити їх, підписуйтесь на наші сторінки! Facebook. Telegram. Viber. Instagram.